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    鼻咽癌細胞通過CD70-CD27相互作用促進調節性T細胞發育和抑制活性

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-04-24
    盡管鼻咽癌腫瘤微環境中存在大量CD8+ T細胞浸潤,但在臨床試驗中,抗PD&nbsp;-1免疫治療的有效率并不理想,受到免疫抑制信號的阻礙......

     

          盡管鼻咽癌腫瘤微環境中存在大量CD8+ T細胞浸潤,但在臨床試驗中,抗PD -1免疫治療的有效率并不理想,受到免疫抑制信號的阻礙。為了了解微環境特征如何改變免疫穩態并限制鼻咽癌的免疫治療效果,作者在此建立了一個基于公開數據的多中心單細胞隊列,包含來自50例患者樣本的357206個細胞。作者揭示了鼻咽癌細胞通過CD70-CD27相互作用增強調節性T細胞的發育和抑制活性。CD70阻斷可逆轉Treg介導的抑制,從而重新激活CD8+T細胞免疫??笴D70 +抗PD -1治療在異種移植類器官和人源化小鼠中進行了評估,顯示出更好的腫瘤殺傷效果。在機制上,CD70敲除抑制了CD4+ na?ve和涉及線粒體完整性、膽固醇穩態和脂肪酸代謝的調節性T細胞中的集體脂質信號網絡。此外,ATAC-Seq表明NFKB2通過Epstein-Barr病毒依賴性表觀遺傳修飾上調CD70的轉錄水平。作者的研究結果確定CD70+鼻咽癌細胞作為一個代謝開關,強制脂質驅動的發展,功能特化和Tregs的穩態,導致免疫逃避。本研究還表明,CD70阻斷可與抗PD -1治療協同作用,重新激活T細胞對鼻咽癌的免疫。本文于2023年4月發表在《Nature Communications》期刊上,IF=16.6。

    技術路線

     

     

    主要研究結果

    1、腫瘤內Treg豐度和激活通過鼻咽癌介導的相互作用進行調節

          為了在單細胞分辨率下全面研究鼻咽癌細胞對腫瘤內T細胞的發育和功能動力學的影響,作者建立了一個大規模的隊列,包含來自36個鼻咽癌組織并被分成41個亞型的189,750個T細胞,10個配對的鼻咽癌外周血樣本和4個來自3個鼻咽癌研究的INP組織(圖1a)。在T細胞亞群中,作者鑒定了三種FOXP3+ Treg亞型,即nTregs、rTregs和eTregs,它們具有不同的轉錄組特征。單細胞軌跡分析推斷出兩種CD4+ T細胞的發育譜系,其中na?ve T細胞在BATF和FOXP3的轉錄驅動下分化為輔助T細胞或eTregs(圖1b, 1c)。

          為了了解CD4+ T細胞亞型是如何在TME中發生譜系轉移的,作者首先量化了患者中每種亞型的標準化豐度。炎癥組織和鼻咽癌外周血樣本中含有豐富的CD4+ na?ve T細胞和SELL+ nTregs部分,而在TME中,這些部分是有限的(圖1d)。在分化的CD4+T細胞亞型中,rTregs和eTregs表現出對TME的偏好,而濾泡輔助T(TFH)細胞和中央記憶T(Tcm)細胞在INP組織中更加豐富(圖1d)。然后,為了證實TME中Treg和樸素的CD4+T細胞之間的動態平衡受到損害,作者建立了兩個使用eTreg和na?ve T細胞特異性信號的多元線性回歸模型,以基于NPC Bulk RNA-Seq隊列計算Treg免疫抑制活性和T細胞na?veness?;诠δ苣K,作者闡明了高Treg和低na?ve T細胞浸潤是NPC患者的惡性標志,并與預后不良相關(圖1e,f)?;趕cRNAseq信號的CIBERSORTx去卷積進一步證實,在NPC患者中,更高的腫瘤內浸潤和Tregs的抑制活性共同導致更差的預后,但與其他臨床參數無關。作為TME中最發達的亞型,eTregs在STAT、TGF-β和干擾素信號共同誘導下,表達最高的免疫抑制信號,如CTLA4、LAYNTNFRSF4,并具有最強的細胞因子通訊、代謝和T細胞抑制活性(圖1g,h)。相反,受規范的WNT信號調節的nTregs和rTregs對T細胞的激活、增殖和凋亡的調節作用最?。▓D1h)??紤]到鼻咽癌中eTreg極化的CD4+T細胞格局,作者假設腫瘤內Treg豐度和抑制活性的共同增加可能是由腫瘤介導的CD4+ na?ve T細胞到Treg的發展和Treg的激活共同引起的。

          因此,為了闡明Tregs在TME中發展和激活的腫瘤依賴機制,作者建立了CD4+ na?ve T細胞與鼻咽癌細胞系C666或正常鼻咽上皮細胞系NP460和NP69(圖1i)直接或間接共培養的體外共培養系統。與在無腫瘤細胞和Transwell共培養系統中誘導CD4+ na?ve T細胞產生Treg相比,直接共培養系統顯示C666細胞增強了從CD4+ na?ve T細胞到FOXP3+Treg的極化,并上調了重要的eTreg標志物CTLA4(圖1j-l)。通過選擇與Treg譜系測定和功能相關的基因面板的qRT-PCR(圖1m),以及共培養系統中分泌的免疫抑制因子,包括IL-10、TGF-β和腺苷的ELISA分析(圖1n),進一步驗證了C666細胞的treg極化和激活作用??傊?,轉錄組分析和功能分析初步表明,鼻咽癌中Tregs的發育和激活受細胞接觸而不是細胞因子通訊的調節。

    圖1 極化CD4+ T na?ve-to-Treg的發展和激活是鼻咽癌的腫瘤特異性特征

     

    2、腫瘤限制性CD70通過與CD27相互作用與Treg豐度和激活相關

          為了進一步確定CD4+ na?ve T細胞、Tregs和NPC細胞之間的確切作用模式,作者使用了兩個成熟的程序,CellPhoneDB和CellChat,它們基于scRNA數據評估細胞-細胞相互作用的強度和方向。CD70-CD27信號是鼻咽癌細胞、原始CD4+T細胞和Treg亞型之間最主要的相互作用之一,并以CD70/CD27表達依賴的方式發生(圖2a,b)。盡管已發現與Treg發育和功能相關的其他相互作用,包括TIGIT、CD226、4-1BBLGALS9,但它們似乎在CD4+ na?ve T細胞和Treg亞型中都沒有上調,在NPC微環境中的eTregs中也沒有明顯增強。因此,CD70-CD27信號被確定為在CD4+ na?ve T細胞、Treg細胞和NPC細胞之間發生的重要的接觸相互作用,從而具有調節TME中從頭Treg發展和抑制活性的潛力。

          CD70-CD27信號是促進Treg增殖的共刺激途徑,但CD70-CD27信號在腫瘤浸潤性Treg的發生和激活中的確切作用和分子機制尚不清楚。因此,作者最初基于Visium數據分析了鼻咽癌細胞、Tregs和CD70表達之間的空間接近性,其中整合的鼻咽癌scRNA-seq數據作為參考,通過基于錨定的反卷積和細胞定位推斷腫瘤和Treg部分。在空間上,Tregs不僅與NPC細胞高度共定位,而且與CD70表達顯著相關(圖2c, 2d),表明CD70+ NPC細胞在調節近端Tregs中起積極作用。作者進一步通過流式細胞術檢測了從新鮮內鏡活檢中分離的鼻咽癌細胞中的CD70表達,顯示大約60%的EPCAM+腫瘤細胞是CD70+,而在EPCAM-浸潤的免疫/基質細胞中只有10%的CD70+細胞(圖2e)。此外,IHC和IF染色顯示原發性鼻咽癌組織中的CD70表達和FOXP3+/CTLA4+ eTreg浸潤明顯高于非惡性鼻咽淋巴樣組織(圖2f、g)。

          盡管少數效應T細胞、B細胞和樹突狀細胞在激活后短暫表達CD70,但單細胞分析證實,CD70在TME中的表達高度局限于鼻咽癌細胞(圖2h)。作者根據中位CD70表達水平將整合scRNA-seq隊列中的患者分為CD70-高和CD70-低兩組,結果顯示CD70-高的患者含有豐富的rTregs和eTregs,但減少了nTregs和CD4+ na?ve T細胞的含量(圖2i)。這種現象在原發性鼻咽癌活檢qRT-PCR上得到了的證實,cd70-高的患者中Treg譜系和激活標志物FOXP3、IL2RA和CTLA4的表達更高(補充圖2h),并根據上述流式細胞術結果進行分層(圖2e)。同時,作者發現T細胞的細胞毒性/增殖與Treg分數之間的負相關僅在CD70高的患者中是明顯的(圖2j),這意味著CD70、Treg和T細胞免疫之間存在反饋回路。

          在大量RNA-seq隊列中,CD70表達在NPC患者中持續上調,并與較差的生存率相關(圖2k, l)。作者進一步發現,C666細胞中CD70+的比例是NP460和NP69細胞的3倍(圖2m),從而誘導了CD70-CD27結合時從共培養的CD4+初始T細胞表面切割出更高的可溶性CD27(SCD27)(圖2n)。在誘導CD4 + na?ve T細胞向Treg分化的時間分辨轉錄組分析中,計算出的Treg抑制評分隨著FOXP3、CTLA4和CD27的表達成比例地增加,而na?ve評分在此過程中呈現相反的趨勢(圖2o)。在大量RNA-seq隊列中,作者確定CD70表達與抑制評分呈正相關,與na?ve評分負相關(圖2p)。這些結果提示CD70+鼻咽癌細胞具有treg極化和激活作用,但它可能雙重依賴于鼻咽癌細胞中的CD70+部分和CD4+ na?ve T細胞和treg中的CD27+部分。

          由于鼻咽癌是一種獨特的EBV+頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC),作者隨后探討了上述CD70+腫瘤細胞與Tregs之間的反饋回路是否存在于其他人類乳頭瘤病毒+ (HPV+) HNCs中。通過分析兩個獨立的HNSCC scRNA-seq隊列,作者發現與正常扁桃體微環境相比,rTregs和eTregs在HPV+ HNSCC微環境中沒有顯著浸潤。此外,CD70在HNSCC細胞中的表達極低,也與HNC患者的預后不良無關。這些結果支持CD70介導的Treg免疫抑制是npc特異性的特征,可能不會導致HPV+ HNSCC患者的腫瘤進展或免疫治療失敗這一觀點。

    圖2 CD70 +鼻咽癌細胞通過與CD4+/CD27+ T細胞相互作用,促進豐富和抑制性Treg浸潤

     

    3、在鼻咽癌細胞中敲除CD70可通過抑制Treg的發育和功能來減輕免疫抑制

           為了闡明CD70對Treg發育和激活的直接影響,作者用活性重組CD70蛋白處理CD4+ na?ve T細胞。激動劑治療通過CD70-CD27相互作用上調CD4+ na?ve T細胞FOXP3和CTLA4的表達,并增加免疫抑制因子的分泌(圖3a-d)。隨后,作者在C666細胞中進行了CRISPR介導的CD70(CD70-KO)基因敲除,這不影響C666細胞中PD-L1的表達或細胞增殖。然而,CD70-KO通過阻斷CD27的相互作用(圖3E-G)顯著地減少了來自CD4+ na?ve T細胞的Treg的發展和激活,并抑制了sCD27、IL-10、TGF-β和腺苷的Treg分泌組(圖3g,h)。其他Treg激活標志物包括ICOS、TNFRSF4、4-1BB(由TNFRSF9編碼)、GITR(由TNFRSF18編碼)和TIGIT的流式細胞儀和qRT-PCR分析進一步證實了Treg抑制活性受損(圖3i)。TIGIT是小組中only不受CD70-KO影響的標記,但這一結果與先前的研究一致,即TIGIT在Treg上的表達不受CD70-CD27共同刺激的影響。Treg抑制實驗進一步證實了CD70-KO功能抑制了配對CD8+T細胞增殖的Treg抑制活性,這與上述結果相呼應。

           考慮到受損Tregs的抑制活性可能會重振CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫,正如大量RNA-Seq數據GSEA分析所分析的那樣,作者建立了以CD4+為主的腫瘤-外周血單個核細胞(PBMC)共培養體系。作者發現C666細胞中的CD70-KO大大增強了細胞毒性依賴性腫瘤細胞的死亡(圖3j - 1),特別是在與鼻咽癌患者生理T細胞全局相似的共培養系統中,CD4+ T細胞上CD27的表達更高。較高的腫瘤細胞死亡率可能直接歸因于CD70- NC C666細胞誘導的共培養CD4+ na?ve T細胞和Tregs中CD70共刺激的缺失,而不是共培養系統中的CD4+和CD8+ T細胞。在CD70-KO系統中,CD8+/顆粒酶A+和CD8+/穿孔素+ T細胞組分、TNF-α和IFN-γ分泌以及CD8+ T細胞增殖均升高,PD-1和TIM-3表達降低(圖3m-q),這表明受損的Treg抑制活性可以重新激活抗腫瘤CD8+ T細胞。

           為了更全面地證明CD70-CD27相互作用對NPC浸潤性T細胞的免疫抑制作用,作者設計了CD19+CD70-NC/ CD19+ CD70-KO C666細胞與抗CD19 CAR-T細胞的自體共培養系統。自體共培養系統可以激活CD4+和CD8+ T細胞中的抗原特異性T細胞,并對CD19+ CD70-NC和CD19+ CD70-KO C666細胞進行抗原特異性殺傷。與同種異體共培養系統的結果相比,CD70-KO在自體共培養系統中的C666細胞中持續抑制Treg極化、激活和抑制活性,從而增強抗原特異性T細胞殺傷和細胞毒性。此外,作者通過PBMC連續攻擊親代C666細胞來模擬鼻咽癌進展過程中的漸進性免疫逃逸,建立了免疫耐藥的C666細胞。作者發現CD70在免疫耐受細胞中的表達持續上調,驗證了CD70+NPC細胞在促進免疫逃避中的積極作用。

           此外,缺乏小鼠鼻咽癌細胞系、自發的小鼠模型以及小鼠無法感染EBV一直阻礙著鼻咽癌免疫學和免疫治療的轉化研究。因此,作者建立了移植PBMC的人源化NSG小鼠模型,以研究CD70-KO C666細胞對浸潤性Tregs發育和抑制活性的體內影響。與體外結果一致,CD70-KO在免疫缺陷的NSG小鼠中沒有改變NPC的體內致瘤性(圖3r),但在人源化的NSG小鼠中導致顯著的腫瘤縮?。▓D3s),進一步證實了CD70在抗腫瘤免疫中的抑制作用。但是H&E染色在CD70-NC和CD70-KO腫瘤中的總免疫浸潤之間沒有顯著差異,但CD70-KO腫瘤中FOXP3+Tregs的比例減少且活性受損,從而降低了TME中IL-10和TGF -β的濃度(圖3t-v)。因此,CD70-KO腫瘤通過促進細胞毒性細胞因子的釋放和防止T細胞耗盡來重振CD8+T細胞的效應譜(圖3t,u)。這些結果提示,鼻咽癌患者中治療性的CD70抑制可能是克服Treg免疫抑制進而激活T細胞免疫的有效策略。

     

    圖3 鼻咽癌細胞中CD70基因缺失可恢復Treg抑制活性,增強TME中CD8+ T細胞功能

     

    4、Cusatuzumab在患者衍生模型中增強抗腫瘤免疫并與抗PD-1治療協同作用

           考慮到CD27在T細胞、NK細胞和B細胞上的高表達,在使用CD27阻斷時可能導致脫靶效應,CD70已成為一個更有效和安全的靶標,因為它在穩態期間不會在正常組織和造血細胞系上表達。Cusatuzumab是一種人αCD70單克隆抗體,可有效阻斷CD70-CD27相互作用及其下游信號通路。到目前為止,cusatuzumab正在多個臨床試驗(NCT04023526和NCT04150887)中對急性髓系白血?。ˋML)患者進行評估,并顯示出對CD70 +白血病干細胞的有效殺傷效果及可控的不良事件。然而,還沒有在臨床前的實體瘤中全面描述cusatuzumab的療效。通過用5 μg/mL cusatuzumab處理C666細胞,作者發現在CD4+ na?ve T細胞共培養系統中,Treg發育、活化、分泌免疫抑制因子以及抑制CD8+ T細胞增殖的能力被抑制到與CD70-KO相當的程度(圖4a-d)。因此,在PBMC共培養系統中,通過促進CD8+ T細胞的增殖和細胞毒性,cusatuzumab治療誘導了更高的腫瘤細胞死亡(圖4e-i)。作者還評估了在PBMC共培養系統中,CD70封閉性抗體對免疫抑制的抑制作用。C666細胞中的CD70阻斷顯示了與cusatuzumab治療相當的腫瘤殺傷和細胞毒性增強效果,進一步證實了CD70抑制在誘導更強的抗腫瘤免疫中是有效的。接下來,在患者來源的原代NPC細胞和自體PBMCs之間的共培養系統中,進一步驗證了cusatuzumab的免疫激活作用。與IgG治療相比,cusatuzumab治療抑制了Tregs的抑制活性,這反過來激活了CD8+ T細胞的效應子功能,最終導致增強的腫瘤殺傷功效。

           在這項研究中,cuatuzumab被證明通過緩解鼻咽癌中Treg的發展和抑制活性來增強T細胞免疫?;蛘?,抗PD-1治療通過防止T細胞耗盡直接釋放CD8+/PD-1+ T細胞的增殖和激活。因此,聯合抗CD70和抗PD-1治療可達到增強抗腫瘤免疫的協同作用。為了研究這種潛在的協同效應,作者首先使用TIDE方法預測CD70高和CD70低的鼻咽癌患者的ICB反應性和T細胞特征。CD70高的鼻咽癌患者預計對ICB阻斷更有抵抗力,表現出更低的T細胞毒性和炎癥,但T細胞排斥率更高。除NPC外,CD70在其他實體腫瘤如黑色素瘤中也優先表達。一些黑色素瘤研究已經從接受ICB的應答者和無應答者中生成了TME轉錄組圖譜,這些圖譜的計算分析表明CD70表達與T細胞功能障礙和較差的ICB結果相關。為了驗證CD70在黑色素瘤中的促腫瘤作用,作者在小鼠黑色素瘤細胞系中進行了CD70-KO:B16-F10,以及在C57BL/6J小鼠中原位注射CD70-NC和CD70-KO B16-F10細胞。CD70-KO導致黑色素瘤顯著縮小,但作者也觀察到CD70-KO對腫瘤的特異性反應,可能是由于小鼠特異性的TME。

           在實驗上,作者評估了CD70+PD-1在模擬鼻咽癌原發腫瘤生理狀態的鼻咽癌器官中的阻斷效果。作者從2018年建立的EBV+NPC患者來源的異種移植(Xeno76)中建立了NPC有機化合物,并相應地評估了CD70和PD-L1在Xeno76中的表達水平(圖4j)。在有機物-PBMC共培養體系中,抗CD70單藥和抗PD-1單藥均顯著增加腫瘤細胞死亡率,但聯合治療在有機物數量、大小和存活率方面顯示出更好的殺瘤效果(圖4k-n)。作者進一步比較了聯合療法和單一療法在移植了Xeno76的PBMC和移植了人源化NSG的NSG小鼠中的體內療效。一直以來,抗CD70+抗PD1聯合治療在抑制患者來源的異種移植(PDX)生長方面顯示出最高的療效(圖4o,p)。同時,腫瘤浸潤性Tregs和CD8+細胞毒性T細胞的比例在接受聯合治療后分別顯著減少和增加(圖4Q),這表明聯合抗CD70和抗PD-1治療獲得了通過克服Treg介導的免疫抑制來刺激T細胞免疫的協同效應。

     

    圖4 治療抑制CD70促進抗腫瘤免疫和抗PD-1療效

     

    5、CD70-CD27信號參與Tregs的脂代謝重編程

           Treg是一種有彈性的T細胞亞型,具有很強的組織適應性和分子靈活性,有助于它們在不同的生態系統中存活、穩態和代謝,包括外周、淋巴結、胸腺和腫瘤。由于作者證明了CD70-KO和鼻咽癌細胞中的抑制通過限制Treg的活性來增強抗腫瘤免疫,作者進一步研究了CD70-CD27信號如何影響Treg下游的動態平衡,特別是在NPC的TME中。因此,作者在與CD70-NC和CD70-KO C666細胞共培養的PBMC中應用了額外的3‘scRNA-seq(圖5a)。與作者的體外和體內結果一致,CD70-KO降低了nTregs、rTregs和eTregs的豐度,擴大了促炎亞型,包括CD8+細胞毒性T細胞、CD4+TFH細胞和CD4+ na?veT細胞(圖5B)。

           此外,與CD70-KO C666細胞共培養的PBMCs中的Tregs (KO-Tregs)表現出譜系特異性(FOXP3, IL2RASOX4),活化(CTLA4LAYN)和共刺激(TNFRSF4TNFRSF9)標記的表達較低,但na?ve (SELL)特征標記的表達較高(圖5c)。特別是,一些共培養的eTreg轉變為脆弱狀態,其先前的特征是FOXP3表達保留,但IFN-γ產生異常。然而,在與CD70共同培養的Treg中,PD-1的上調保護了這些細胞免受干擾素誘導的脆弱性,同時保持了功能穩態(圖5c)。因此,在抗CD70治療中加入PD-1阻斷后觀察到的協同作用也可能通過誘導Treg脆弱性來部分減少免疫抑制。CD70-KO組CD8+細胞毒性T細胞的增殖(MKI67)、細胞毒性(GZMA和LTB)和活化(TNFRSF1B和CD28)標志物的表達增加,而na?ve (Tcf7和CCR7)和衰竭(LAYN、LAG3和HAVCR2)標志物的表達降低,進一步證實阻斷Tregs的抑制活性促進了CD8+T細胞的增殖、激活和緩解衰竭(圖5d)。CD70介導的Treg免疫抑制也阻礙了CD8+細胞毒性T細胞的炎癥反應,從而降低了它們的抗腫瘤效果。

           為了進一步闡明CD70-CD27信號在Tregs中的下游機制,作者對CD70誘導的Tregs和KO-Tregs進行了GSEA。CD70+C666細胞通過增強由復雜的脂質信號網絡驅動的氧化磷酸化(OXPHOS),有效地重新編程共培養的Treg的代謝譜(圖5e)。Treg經常需要強健的新陳代謝來維持它們在TME中的發育和抑制活動。特別是,Treg具有高能量驅動的可塑性,因此可以利用不同的代謝資源,包括乳酸、葡萄糖和脂肪酸(FAs),在代謝物缺乏的環境中維持功能平衡。通路分析表明,脂肪酸代謝、膽固醇穩態和線粒體功能是CD70誘導的Tregs中最豐富的信號,最近報道這些信號有助于Treg譜系確定、功能適應和免疫抑制(圖5e)。例如,由脂肪酸氧化驅動的OXPHOS增加是TME中Treg發展和抑制活性的標志。同時,上調的解毒和氧化還原穩態保護CD70誘導的Tregs免受OXPHOS和ATP產生的高水平活性氧物種的影響,同時保持線粒體的完整性(圖5f)。相反,KO-Tregs由于脂質外流和清除增加以及線粒體完整性喪失而表現出功能動態平衡受損(圖5f)。

     

    圖5 單細胞分析顯示CD70-CD27信號增強Tregs中脂質驅動的OXPHOS

     

    6、線粒體的完整性、膽固醇的穩態和脂肪酸的氧化共同促成了Treg的功能特化

           為了從機制上了解CD70誘導的復雜脂質網絡如何在鼻咽癌微環境中增強Tregs的功能特化和動態平衡,作者評估了CD70-NC和CD70KO C666細胞共同培養的CD4+T細胞內總脂和關鍵脂成分(如膽固醇和脂肪酸)的變化。首先,鼻咽癌細胞中CD70的基因缺失和治療抑制顯著降低了共培養的Treg細胞的細胞內總脂質和膽固醇(圖6a,b)。其次,從FOXP3-非Tregs、FOXP3+/CTLA4-rTregs到FOXP3+/CTLA4+eTregs,細胞內膽固醇增加,這表明細胞內膽固醇積累與Treg的發展和抑制活性有關(圖6c)。在整合的NPC scrna-seq隊列中,作者證實eTregs具有更強勁的膽固醇代謝和生物合成,但膽固醇輸出較低。

           考慮到脂質信號是一個高度復雜的網絡,涉及各種代謝物的細微變化,作者進行了基于質譜的代謝組學,以量化共培養CD4+ T細胞中極性分子和脂肪酸的細胞內代謝變化(圖6c)。質譜分析顯示,CD70-KO組細胞內膽固醇和腺苷持續下降,CD39表達降低(圖6d)。同時,增加甘油可以保護Tregs免受脂質累積毒性,后者損害FOXP3的穩定性(圖6d)。OXPHOS衍生的代謝物被積極代謝,包括琥珀酸鹽、2-羥基戊二酸鹽(2-HG)和蘋果酸鹽,被積極代謝(圖6d),這些代謝物之前被報道與Treg發育受損和通過PD-1的表觀遺傳抑制活性相關。而CD70-NC組、CD70-KO組和CD4+ T組細胞中的檸檬酸鹽、天冬氨酸和谷氨酰胺保持不變。脂肪酸組,CD70-KO組總脂肪酸含量明顯降低(圖6d)。幾乎所有細胞內脂肪酸衍生物C4到C26的濃度都降低了,這表明阻斷Tregs中CD70-CD27信號通路可能會破壞新生脂肪酸的攝取、合成和氧化。

           基于觀察到的Tregs在CD70/CD27介導的脂質信號傳導中的代謝適應,作者提出線粒體完整性、膽固醇穩態和脂肪酸代謝共同促成了Tregs在NPC微環境中通過CD70-CD27信號傳導的代謝優勢和功能特化。作者推測CD70作為一個主代謝開關,重新編程CD4+ na?ve T細胞和Treg的脂質代謝,以滿足這些細胞在惡劣環境中Treg發育、穩態和激活的代謝需求。為了驗證作者的假設,作者首先在電鏡下發現KO-Tregs的線粒體較少且不健康(圖6e),導致海馬實驗和JC-1染色顯示的ATP生成、OXPHOS和線粒體電位減少(圖6f-h)。此外,作者評估了Tregs中46個參與脂質合成、運輸和氧化的代表性基因的變化,其中超過70%的選定特征受到CD70-CD27信號傳導的顯著影響(圖6i)。

           鑒于CD70誘導的Tregs細胞內膽固醇升高,作者首先檢查了參與調節膽固醇攝取的LDLR的變化。有趣的是,在CD70誘導的Tregs中,LDLR的表達并未增加,而膽固醇外排相關基因(如SCARB1和SDC1)被發現下調,這表明膽固醇積累是由抑制膽固醇輸出引起的。此外,通過甲羥戊酸途徑參與膽固醇代謝和Treg穩態的關鍵調節因子和酶,包括SREBF1、SREBF2、HMGCS1、SOAT1、SOAT2、FNTB、PGGT1B、GGPS1、RAC2PD-1,促進Treg的發育和維持,也被CD70-CD27信號增強(圖6i)。

           脂肪酸攝取和重新合成引起的Tregs細胞內脂肪酸積累積極參與IL-2依賴性增殖和TCR依賴性活化。通過BODIPY C12示蹤和FAO通路中的三種酶(ACADVL、ACADM和HADHA)水平確定,CD70-KO在共培養的CD4+ T細胞中損害了脂肪酸攝取和氧化。在CD70共培養的CD4+ na?ve T細胞中,增加的ACACA而不是FASN,也可能通過重新合成FA促進細胞內脂肪酸積累,從而上調TCR依賴的Treg激活和成熟標記TNFRSF18CD44(圖6i)。如上所述的代謝實驗表明,CD70誘導的Treg中積累的脂肪酸庫通過線粒體OXPHOS為FAO提供了足夠的資源,這些資源持續產生ATP,足以滿足Treg功能化和TME中生存的高能量需求。

           以前已經證明線粒體復合物III對于Treg抑制活性和增強FAO驅動的OXPHOS是必需的。與線粒體復合體III的完整性和功能相關的UQCRFS1,UQCRQCYC1,在由CD70-CD27信號激活的Tregs中上調,與電子顯微鏡圖像協調一致(圖6e,i)。作者還發現TCA循環和電子傳遞鏈(ETC)中關鍵調節因子和酶的上調,包括NR4A1、NR4A2、MDH1、MDH2、ECHS1ECH1(圖6i)。其他轉錄因子,包括STAT5A和cAMP誘導因子,如CREB1CEBPB,與Tregs的代謝適應性相關,可能確保Tregs在NPC微環境中的功能特化(圖6i)。然而,其他幾個重要的脂質代謝相關基因,包括SQLE,SCAP,HMGCR,ATF4,CCDC5B,LAGLS3,CTNB1EGR1,沒有差異表達(圖6i),表明在腫瘤特異性的神經干細胞內,Tregs中存在一種可替代的和獨立于CD70之外的脂質信號。

           作者進一步構建了脂質信號模塊,其包含基于多元線性回歸從qPCR組中選擇的15個代表性簽名基因,以定量評估單細胞和大量轉錄組數據集中Tregs和其他CD4+ T細胞中的脂質信號活性。

           首先,NPC細胞中CD70的基因去除顯著損害了共培養Tregs中的脂質信號傳導(圖6j)。同時,在整合的NPC單細胞群組中,eTregs具有最高的脂質信號傳導活性,超過rTregs、nTregs和其他CD4+亞型,包括TFH細胞、TCM細胞和na?ve細胞(圖6k)。在時間分辨的Treg分化模型中,脂質信號活性與na?ve T細胞至Treg分化期間的Treg抑制評分和CD25表達正相關,與幼稚評分和IL7R表達負相關(圖6l)。在大量RNA-seq群組中,脂質信號傳導活性與Tregs的抑制活性和NPC患者的不良預后高度相關(圖6m,n)。此外,在GTEx的337份全血樣本的轉錄組數據中,15個代表性特征基因與CD70、CD27、FOXP3、CTLA4CD25之間的相關性得到了獨立驗證(圖6o),表明脂質模塊與Treg活性在個體中一致相關??傊?,這些發現表明脂質代謝重編程和CD70-CD27信號在譜系確定、穩態和NPC浸潤Tregs抑制活性中的密切合作。

           為了驗證脂質代謝在CD70誘導的鼻咽癌微環境中Treg的發展和激活中的重要性,作者評估了CD70-NC和CD70-KO與去脂微環境共培養時的功能和代謝變化。在去脂共培養系統中,CD70+ NPC細胞不再誘導CD4+ na?ve T細胞分化出更高比例的總活化treg,也不再誘導更強的CD8+ T細胞增殖抑制(圖6p, q)。在脂質耗盡系統中,CD4+ T細胞與CD70-NC和CD70-KO C666細胞共培養的免疫抑制分泌組譜也沒有差異(圖6r)。因此,脂質缺失也導致CD70-CD27相互作用不能調節NPC-PBMC共培養系統中的Treg免疫抑制,導致CD70-NC組和CD70-KO組的抗腫瘤免疫增強(圖6s)。此外,由于缺乏可被吸收和合成的游離脂,NC-Tregs和KO-Tregs的細胞內總脂質含量保持不變(圖6T)。代謝分析進一步表明,即使在CD70-CD27信號活躍的情況下,脂肪缺失時,Tregs的ATP生成、OXPHOS、線粒體完整性和脂肪酸氧化也顯著受損(圖6u-x)。這些結果成功地證明了CD70CD27相互作用對于促進鼻咽癌浸潤性樹突狀細胞的發育、動態平衡和抑制活性是必不可少的脂代謝。

     

    圖6 脂質信號促進Treg發育、動態平衡和抑制活性

     

           由于CD70在鼻咽癌組織中的過度表達在臨床上經常被觀察到,作者想要探討CD70介導的免疫逃避的上游機制。單細胞分析發現,CD70的轉錄組水平在EBV+NPC細胞中顯著過表達(圖7a)。作者證實,與EBV-對應物相比,EBV+ NPC43細胞中的CD70+ 分數更高(圖7a)。NPC的EBV感染導致基因組不穩定,因此表觀遺傳學刺激癌基因的轉錄以促進腫瘤進展和免疫逃逸。據報道,染色體19上的CD70基因的染色體位點在NPC經常被擴增。因此,為了描述CD70在NPC的過度表達是否是由EBV介導的染色質可及性改變引起的,作者對EBV+ NPC細胞、EBV- NPC細胞和NPE細胞進行了ATAC序列分析。與EBV-和正常對應物相比,EBV+ NPC細胞中CD70啟動子區域的染色質可及性增強,使得轉錄因子結合更有效,從而促進CD70 mRNA轉錄(圖7b)?;贏TAC分析,作者鑒定了在EBV+ NPC細胞中具有最高轉錄活性的前15個轉錄因子,其可能以更高的可及性與CD70啟動子區域結合(圖7c)。在15個轉錄因子中,作者表征了NFKB2是在兩個NPC RNA-seq隊列和Visium空間數據中驗證的與CD70表達最相關的一個,并且具有與JASPER預測的CD70啟動子區域的最高結合分數圖(7d,e)。在EBV-感染的淋巴細胞中,還發現NFKB2CD70高度相關,表明在免疫和上皮細胞中一致的EBV調節的表觀遺傳學(圖7f)。

           NFKB2是NF-κB通路的主要調節因子,NF-κB通路被廣泛認為是NPC啟動和進展的同質驅動因子。NFKB2經常在EBV+ NPC細胞中過表達,而不是在TME中的EBV-腫瘤細胞、NPE細胞、基質細胞和免疫細胞中過表達(圖7g),并且先前已經顯示促進腫瘤生長和存活。然而,其對NPC免疫逃避的調節作用以及與CD70上調的分子連鎖尚未被全面闡明。因此,為了描述NFKB2對CD70轉錄的調節作用,作者在CD70啟動子區域確定了NFKB2獨特的結合基序,該基序因EBV感染而增強了可及性(圖7b)。因此,作者設計了一個點突變的CD70與熒光素酶結合的基序,并證明了NFKB2可以特異性地和有效地結合到這個位點上,以增強CD70的轉錄(圖7h)。為了進一步驗證NFKB2作為CD70轉錄增強子的作用,作者在C666細胞中進行了NFKB2基因敲除和抑制,顯示CD70 mRNA和CD70蛋白持續下降(圖7i至7k)。C666細胞中NFKB2的丟失使它們在PBMC共培養系統中對免疫攻擊敏感(圖7l,m)。這些數據揭示了EBV-NFKB2-CD70軸是鼻咽癌細胞通過上調Treg免疫抑制來逃避免疫監視的重要機制,Treg免疫抑制降低了T細胞免疫。

     

    圖7 EBV感染增加CD70啟動子染色質可及性并通過NFKB2促進CD70轉錄

     

           總之,作者的多組學驅動的功能研究為在鼻咽癌微環境中如何發展、激活和維持Tregs提供了臨床前的見解,并表明CD70抑制是一種治療上可行的方法,可以克服免疫抑制的TME,協同提高抗PD-1治療的療效??笴D70+抗PD-1聯合治療可能對晚期或耐藥鼻咽癌患者產生特殊的益處,優化了這些患者的常規治療。作者還認為,多組學NPC T細胞隊列以及已建立的功能模塊,如Treg抑制、T細胞幼稚和Treg脂信號模塊,可以應用于其他惡性腫瘤腫瘤浸潤性T細胞的免疫抑制和代謝重編程的未來研究,或用于定量評估免疫治療反應的常規臨床應用。最后,這種由CD70-CD27信號誘導的脂質驅動的免疫抑制機制為鼻咽癌患者開辟了CD70靶向精確治療的新途徑,并可能對黑色素瘤患者有效,這取決于他們特定的TME環境。

     

    實驗方法

    單細胞測序、偽時間發育軌跡、單細胞基因集變異分析(GSVA)、細胞培養、流式細胞術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、qRT-PCR、細胞間通訊分析、空間轉錄組測序和分析、免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)、Treg抑制試驗、細胞增殖和存活分析、細胞凋亡分析、CFSE染色和分析、慢病毒包裝、小鼠模型的建立及異種移植、GSEA分析、油O紅染色和定量、代謝組學、雙熒光素酶報告基因測定

    參考文獻

    L. Gong, J. Luo, Y. Zhang, et al. Nasopharyngeal carcinoma cells promote regulatory T cell development and suppressive activity via CD70-CD27 interaction, Nature Communications 14(1) (2023).

     


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