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    生理代謝物α-酮戊二酸通過調節線粒體自噬和氧化應激來改善骨關節炎

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-04-19
    α-KG在人骨關節炎軟骨和IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中的含量減少,α-KG可通過調節線粒體自噬和氧化應激來減輕骨關節炎的表型......

     

           骨關節炎(OA)是一種與年齡相關的代謝性疾病。低度炎癥和氧化應激是OA最后的常見途徑。α-酮戊二酸(α-KG)是線粒體三羧酸(TCA)循環中必需的生理代謝產物,具有抗炎和抗氧化等多種功能,并且隨著年齡的增長,血清水平會降低。本研究旨在探討α-KG對骨性關節炎的治療作用及其機制。作者首次定量檢測了α-KG在IL-1β誘導的人軟骨組織和骨關節炎軟骨細胞中的表達水平。此外,對IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞用不同濃度的α-KG進行處理。分析軟骨細胞的增殖和凋亡、細胞外基質的合成和降解以及炎癥介質。用核糖核酸測序的方法探討α-KG的作用機制,并進一步檢測吞噬作用和氧化應激水平。這些結果在前交叉韌帶切斷(ACLT)誘導的年齡相關性骨關節炎大鼠模型中得到了驗證。作者發現損傷的內側軟骨α-KG含量比正常外側軟骨減少了31.32%,IL-1β誘導的人骨關節炎軟骨細胞比對照組減少了36.85%。α-KG可逆轉IL-1β誘導的軟骨細胞增殖抑制和細胞凋亡,增加ACAN和COL2A1的轉錄和蛋白表達,但抑制MMP13、ADAMTS5、IL-6和TNF-α的表達。在機制上,α-KG促進有絲分裂,抑制ROS的產生,這種作用可被Mdivi-1(有絲分裂抑制物)所阻斷??傮w而言,α-KG在人骨關節炎軟骨和IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中的含量減少。此外,補充α-KG可通過調節線粒體自噬和氧化應激來減輕骨關節炎的表型,提示其有可能成為改善骨關節炎的治療靶點。本文于2023年6月發表于期刊《Redox Biology》,IF=11.4

    主要技術路線

     

     

    主要研究結果

    1、人骨關節炎軟骨中α-KG含量及IL-1β對軟骨細胞增殖和凋亡的影響

           α-KG是戊二酸的酮基衍生物之一(圖1A),戊二酸來自異檸檬酸,在生理上產生丁二酰輔酶A(圖1B)。因此,作者首先檢測了α-KG在IL-1β誘導的人軟骨組織和軟骨細胞中的含量(圖1C)。結果表明,損傷內側軟骨α-KG含量較正常外側軟骨降低31.32%(P<0.0821,圖1D),人軟骨細胞經IL-1β處理24 h后含量下降36.85%,但差異無統計學意義(P=0.0821,圖1E)。然后,檢測α-KG對原代人軟骨細胞的影響。CCK-8實驗顯示,當α-KG濃度小于2 mM或作用時間小于72h時,對軟骨細胞活力無明顯影響(P<0.05,圖1F,G)。因此,作者觀察了2 mM α-KG作用24 h對IL-1β誘導的人軟骨細胞增殖和凋亡的影響。EDU結果顯示,IL-1β可抑制原代培養的人軟骨細胞的增殖,而α-KG可逆轉這一作用(圖1H和I)。流式細胞儀檢測顯示,IL-1β可促進原代培養的人軟骨細胞的凋亡,α-KG也可在一定程度上減輕這一作用(圖1J和K)。

     

    圖1 α-KG含量及其對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖和凋亡的影響

     

    2、α-KG對IL-1β誘導的軟骨細胞骨性關節炎表型的影響

           除軟骨細胞外,細胞外基質(ECM)是軟骨組織的另一個主要成分。因此,采用RT-qPCR方法檢測基質合成相關基因(ACAN和COL2A1)和降解相關基因(MMP13和ADAMTS5)在轉錄水平的表達。結果表明,α-KG以濃度依賴的方式促進IL-1β誘導的骨關節軟骨細胞ACAN和COL2A1 mRNA的表達,抑制MMP13和ADAMTS5的表達(P<0.05,P<0.01,圖2A-D)。IF染色和免疫印跡結果顯示,α-KG以濃度依賴的方式促進IL-1β誘導的人軟骨細胞COL2A1蛋白表達,抑制MMP13蛋白表達(P<0.01,圖2E-G)。進一步檢測α-KG對炎癥介質的影響。RT-qPCR法和Western印跡結果顯示,IL-1β可濃度依賴性地上調人軟骨細胞IL-6和TNF-α的轉錄和蛋白表達水平,而α-KG則以濃度依賴的方式降低IL-6和TNF-α的轉錄和蛋白表達水平(P<0.05,P<0.01,圖2G-I)。

     

    圖2 α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞基質合成、降解及炎癥反應的影響

     

    3、α-KG對骨關節炎軟骨細胞線粒體自噬和ROS生成的影響

           為了探討α-KG減輕骨性關節炎表型的機制,對其進行了測序。測序結果表明,與對照組相比,IL-1β處理組降低了與基質合成相關的基因(ACAN和COL2A1)的轉錄表達,上調了與基質降解(如MMP3、MMP9、MMP10、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL1、ADAMTS5、ADAMTS7和ADAMTS8)和炎癥介質相關基因(如IL-1α、IL-1R、IL-6、IL-6R、NFKBIA、TNFRSF9和TNFRSF15)的表達(圖3A)。然而,與單獨處理IL-1β相比,α-KG與IL-1β聯合作用上調了與基質合成相關的基因(COL2A1),下調了與基質降解(如MMP9、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL2、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS9和ADAMTS12)和炎癥介質(IL-6ST、IL-6R、NFKBIA、TNFSF8和TNFSF15)相關基因的表達(圖3B)。有趣的是,與線粒體自噬相關的基因表達的變化與與基質合成、降解和炎癥介質相關的基因的表達一致。IL-1β降低PINK1、ATG4D和JUN的轉錄表達,而α-KG增加PINK1、PARKIN、ATG4D、JUN、TOMM7和DAPK2的表達(圖3A和B)。KEGG分析還顯示了與炎癥、增殖、凋亡、氧化磷酸化和有絲分裂相關的通路的變化(圖3C)。

           因此,進一步用透射電子顯微鏡檢測有絲分裂吞噬作用。結果顯示,IL-1β誘導的軟骨細胞線粒體形態正常、規則、完整,但腫脹、空泡化、密度降低、結構不完整。α-KG的加入改善了線粒體結構,促進了線粒體自噬,從而增加了IL-1β誘導的軟骨細胞中受損線粒體的清除(圖3D)。免疫熒光共定位顯示α-KG增加了IL-1β誘導的人軟骨細胞中線粒體和溶酶體的相互作用(P<0.05,P<0.01,圖3E)。Bafilomycin A1,可以通過抑制溶酶體酸化阻止晚期自噬通量,被進一步測定自噬通量。結果顯示,α-KG顯著增加IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞的自噬通量(P<0.01)。RT-qPCR和western blot也證實α-KG上調了線粒體自噬標志物(PINK1和Parkin)相關基因的表達(P < 0.05, P < 0.01,圖4A, B)。最后,檢測線粒體功能。結果表明,α-KG處理顯著提高了IL-1β誘導的軟骨細胞基礎呼吸、最大呼吸、ATP相關的線粒體呼吸和備用呼吸能力(P < 0.05, P < 0.01)。同時,α-KG也能降低IL-1β誘導的人軟骨細胞中ROS的生成(P < 0.05, P < 0.01,圖4C)。提示α-KG增加骨關節炎軟骨細胞的線粒體自噬,改善線粒體功能,抑制ROS生成。

     

    圖3 α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞線粒體自噬的影響

     

    4、Mdivi-1對軟骨細胞α-KG活性的影響

           已經證實Mdivi-1是一種線粒體自噬抑制劑。為了進一步探討線粒體自噬在介導α-KG對IL-1β誘導的人軟骨細胞骨關節炎表型的緩解作用中的作用,作者采用Mdivi-1聯合α-KG治療IL-1β誘導的軟骨細胞。TEM和IF結果顯示,α-KG和Mdivi-1抑制了線粒體和溶酶體共定位,改善了線粒體形態,增加了ROS的產生(P < 0.05, P < 0.01,圖3D和E,4C)。α-KG與Mdivi-1聯用也降低了PINK1和Parkin的轉錄組和蛋白表達(P < 0.05, P < 0.01,圖4A,B),這些結果表明Mdivi-1逆轉了α-KG對線粒體自噬的影響。

           用EdU和流式細胞術檢測軟骨細胞的增殖和凋亡情況,發現Mdivi-1可以抵消α-KG促進增殖和抑制細胞凋亡的作用(且有增強的趨勢)(P = 0.0564, P < 0.01,圖1H-K)。補充α-KG后,藏紅花O染色增強,但可被MDVI-1抑制(P<0.01,圖4D)。RT-qPCR結果顯示,Mdivi-1逆轉了α-KG誘導的人軟骨細胞基質合成相關基因(ACAN和COL2A1)轉錄表達增加(P<0.05,P<0.01,圖4E和F),基質降解相關基因(MMP13和ADAMTS5) (P<0.05,P<0.01,圖4G),以及炎性介質(IL-6和TNF-β)表達降低(P<0.01,圖4H和I)。Western印跡和進一步證實Mdivi-1可抑制COL2A1蛋白表達的增加和MMP13、IL-6和TNF-α的表達降低(P=0.0559,P<0.05,P<0.01,圖4J)。

     

    圖4 Mdvi-1對人軟骨細胞α-KG活性的影響

     

    5、補充α-KG對大鼠骨性關節炎表型的影響

           為進一步評價α-KG的作用,采用ACLT建立大鼠骨性關節炎模型。番紅O-固色綠染色顯示,α-KG修復后,ACLT可引起軟骨脫落、潮標中斷或消失、軟骨纖顫、軟骨裂隙和侵蝕、軟骨變薄和OARSI評分增加(P<0.01),這些可由α-KG恢復(P < 0.01,圖5A和B)。RT-qPCR顯示,與對照組相比,ACLT可下調軟骨基質合成相關基因(ACAN和COL2A1)的表達水平,上調與基質降解相關的基因(MMP13和ADAMTS5)和炎癥介質(IL-6和TNF-α)的基因表達水平,而ACLT+α-KG組則相反(P<0.05,P<0.01,圖5C-H)。免疫組化進一步證明,α-KG逆轉了ACLT誘導的COL2A1蛋白表達下降和MMP13水平升高(P<0.01,圖5I,J)。

     

    圖5 補充α-KG對大鼠骨性關節炎模型的影響

     

    6、補充α-KG對軟骨組織線粒體自噬的影響

           最后,對軟骨組織進行線粒體自噬實驗。透射電子顯微鏡顯示,ACLT+α-KG組線粒體腫脹、空泡化、結構不完整,線粒體形態正常、規則、完整(圖6A)。RT-qPCR和IHC證實人骨關節炎軟骨組織中PINK1和Parkin的轉錄表達和Parkin的蛋白水平降低(P<0.05,P<0.01,圖6B,C)。在ACLT誘導的大鼠骨性關節炎軟骨組織中,PINK1和Parkin的轉錄和蛋白表達也持續下降(P<0.05,P<0.01,圖6D-G)。然而,α-KG可逆轉上述作用(P<0.05,P<0.01,圖6D-G)。上述結果表明,α-KG可降低骨關節炎大鼠軟骨組織的線粒體自噬水平,并促進其軟骨組織的線粒體自噬作用。

     

    圖6 補充或不補充α-KG的人OA軟骨和ACLT誘導的大鼠OA模型中線粒體自噬的變化

     

           總體而言,這項研究證實,在人OA軟骨和IL-1β誘導的骨關節炎軟骨細胞中,α-KG(線粒體TCA循環的一種生理代謝產物)的含量降低。此外,補充α-KG可以促進軟骨細胞增殖和凋亡抑制,逆轉體內外細胞外基質合成減少和降解增加以及炎癥反應,減少氧化應激。這是由α-KG促進軟骨細胞和軟骨組織線粒體自噬的能力介導的。此外,線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以抑制α-KG的作用。簡而言之,作者的研究結果提供了迄今為止未記錄的α-KG在維持軟骨穩態中的作用證據,表明它可以成為OA的潛在治療靶點和藥物。

     

     

     

    實驗方法

    CCK-8、EdU檢測、流式細胞術、蛋白質印跡、RT-qPCR、免疫組化、RNA測序、大鼠實驗

    參考文獻

    L. Liu, W. Zhang, T. Liu, Y. Tan, C. Chen, J. Zhao, H. Geng, C. Ma, The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress, Redox Biology 62 (2023).

     

     

     


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